قارچ خوراکی مناطق گرمسیر - قسمت سوم

همانطور که در قسمت های پیشین مقاله ذکر شد، Volvarialla قارچ خوراکی متعلق به مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری و متعلق به خانواده Plutaceae Kolt &Pouz از رده بازیدیومیست هاست. این قارچ را عموما تحت عنوان (قارچ خوراکی کلشی) (قارچ خوراکی کلش شالیزار) و یا (قارچ خوراکی چینی) می شناسند. در شماره های قبل در خصوص مشخصات بیولوژیکی، مورفولوژیکی مراحل بلوغ، طویل شدن، دکمه ای، تخم مرغی، تندش و تشکیل ریسه و کلامیدوسپورها در قارچ والواریلا صحبت شد. در این قسمت به روش های کشت قارچ می پردازیم و باهم می خوانیم.

10- روشهاي كشت قارچ V.volvacea
الف ) توليد اسپان: اسپان محيطي است كه بوسيله مسيليومهاي قارچ مايه كوبي شده و بعنوان بذر براي كشت قارچ مورد استفاده قرار ميگيرد اين محيط بايد با رعايت كليه موارد بهداشتي و تحت شرايط ضدعفوني شده تهيه گردد.
میسلیومی که برای تهیه اسپان مورد استفاده قرار میگیرد اهمیت خیلی زیادی دارد و باید از تولید محصول قابل اطمینان  توسط آن یقین حاصل نمود.کشت قارچ V.volvacea در بین سایر قارچهای خوراکی از این نظر که نمی توان آن را در دمای 5 درجه سانتی گراد نگهداری کرد و قارچ در این دما زنده نمی ماند منحصر به فرد است.بنابراین کشت این قارچ را نمی توان در دمای یخچال نگهداری کرد.میسلیومهای این قارچ در دمای 30 درجه سانتی گراد برای بیشتر از 6 ماه و یا حتی یک سال مادامی که آگاری که بر روی آن رشد میکند خشک نشده است می تواند زنده بماند.نژادهای مختلف عکس العمل های مختلفی به دمای 20-15 درجه سانتی گراد نشان می دهند اما عموماً میتوان آنها را در این دما تا حتی برای یک سال نگهداری نمود.کشت قارچ V.volvacea را نمی توان به سایر روشهای نگهداری مثل نگهداری در روغن معدنی و یا آب استریل مقطر حفظ نمود.پس از چندین بار انتقال به محیط کشت جدید قارچ شروع به تجزیه شدن نموده و لذا لازم است کشت جدیدی از قارچ به روش تک اسپور کردن یا کشت بافت تهیه گردد.تنها روش حفظ کیفیت قارچ بدون کمترین تأثیر در کیفیت آن به نظر می رسد انجماد سریع در ازت مایع باشد(Baker,1934).تشکیل کلامیدوسپورها یکی از مشخصات کشت V.volvacea است.به عقیده چانگ وجود و تشکیل کلامیدوسپور در کشت این قارچ بیانگر کیفیت خوب رشد قارچ است چرا که این اسپورهای غیر جنسی بعنوان واحدهای ذخیره کننده و برقرار کننده تعادل محتوای سلول ها هستند .این اسپورها منبع تکثیر قارچ هستند و هر کدام قادر به تولید شبکه ای از میسلیومها هستند.ظهور کلامیدوسپورها بیانگر کیفیت و رسیدگی کشت قارچ است، بنابر این اسپان حاوی این اسپورهای صورتی یا متمایل به قهوه ای بوسیله بسیاری از تولید کنندگان مورد ترجیح است(Chang,1964)(شکلهای9 و10).
بستره اسپان:بطور کلی دونوع اسپان وجود دارد: اسپان مادر و اسپان کشت(شکلهای11 و 12).

 شکلهای 9 و 10: کلامیدوسپورهای قارچ V.volvaceaدر کشت دوهفته ای قارچ( سمت چپ). کلامیدوسپورهای صورتی رنگ در اسپان قارچ( سمت راست).

 شکلهای 11و 12: اسپان تهیه شده از خاک اره یا کلش برنج به همراه سبوس( سمت راست). اسپان بذر مایه زنی شده قطعاتی از محیط کشت حاوی قارچ( سمت چپ).


   اسپان مادر معمولاً از دانه هایی مثل چاودار،گندم ، ارزن و سوگوم تهیه می شود که بوسیله یک تکه محیط کشت حاوی قارچ مایه کوبی می شود.اسپان کشت، اسپانی است که برای مایه زنی کیسه های حاوی بستر V.volvacea استفاده می شود .از اسپان مادر برای تهیه اسپان کشت استفاده می شود.برای تهیه اسپان کشت می توان از انواع مواد سلولزی مثل ضایعات پنبه ، پسمانده چای رستورانها ،ضایعات روغن نخل بسته به موجودی آنها در منطقه، استفاده کرد.از خاک اره هم می توان برای تهیه اسپان کشت استفاده نمود.ماتیرو و کویمبوگزارش دادند که استفاده از خاک اره مخلوط با 10 تا 20 درصد آرد ذرت ،سبوس برنج و یا گندم  ، منجر به تولید محصول مناسبی خواهد شد(Quimbo, 2002). V.volvacea به دلیل اینکه قادر به تولید آنزیمهای تجزیه کننده لیگنین و فنول اکسیداز نیست وجود مواد فنولیک و تانن ها در کشت این قارچ می تواند از رشد آن جلو گیری کند.بنابر این اضافه کردن بیش از حد مکمل ها می تواند سبب بروز پدیده ذکر شده در بالا گردد.
شروع كشت: براي شروع كشت قارچ V.volvacea از هر يك از چهار روش زير ميتوان استفاده كرد:
دريافت كشت خالص قارچ از يكي دوستان و يا خريداري از شركتهاي كه در كار تهيه ايزولههاي خوراكي تخصص دارند.
جمع آوري اسپورهاي قارچ بصورت يك اسپور پرينت و سپس رشد دادن اسپورها براي تهيه كشت تك اسپور.
تهيه كشت چند اسپوري (Multispord culture).
استفاده از قطعهاي از بافت يك اندام باردهي تازه.
همه بافتهايي كه در چرخه زندگي قارچ دخالت دارند را ميتوان براي تهيه كشت از قارچ مورد استفاده قرار داد. مراحل تهيه اسپورپرينت، كشت چند اسپوري و تكنيكهاي كشت بافت به شرح زير ميباشد.
- روش كشت اسپورپرينت:يك كلاهك بالغ(باز شده) انتخاب شده و ساقه از محل اتصال به كلاهك از آن جدا ميشود. سپس كلاهك بر روي يك صفحه كاغذ تميز قرار ميگيرد و به مدت ده دقيقه كلاهك بر روي كاغذ باقي ميماند. اولين اسپوپرينت به دليل احتمال آلودگي به باكتريها و ديگر ميكروارگانيزمها دور ريخته ميشود. سپس مجدداً كلاهك بر روي يك صفحه كاغذي تميز ديگر قرار داده ميشود و براي جلوگيري از جريان هوا بوسيله يك بشرتمیز پوشانده ميشود. پس از تا 20 تا 30 دقيقه اسپورهاي زيادي بر روي كاغذ جمع ميشود. اين پرينت براي مايه كوبي قارچ مناسب است.
-  تكنيك كشت چند اسپوري:- قبل از مايه كوبي ميز كار را با Lysolسه درصد تميز کردهو دستها با الكل 70% ضد عفوني میشود.  لوپ مايه كوبي را بوسيله حرارت چراغ الكلي ضدعفوني کرده و با فرو كردن در آب مقطر استريل سرد میکنند، سپس بااستفاده از لوپ مقداري از اسپورها را از روي كاغذ برداشته ودر شرايط ضدعفوني شده اسپورها را به لوله آزمايش حاوي محيط كشت انتقال میدهند. بلافاصله پس از خارج كردن لوپ از درون لوله مجدداً  آن را حرارت دداده تا از انتشار اسپورها جلوگيري شود. كشت را به مدت 5-4 روز در دماي 30 تا 32 درجه سانتيگراد نگه داري نگه میدارند.
- روش كشت بافت (با استفاده از بازيديوكارپ بالغ باز نشده)
- قارچ را به طور كامل با آب میشویند و آنرا با كاغذ خشك كن به آرامي خشك میکنند.
- ميز كار را با lysol سه درصد يا مواد ضدعفوني كننده مشابه تميز کرده و دستها با الكل 70% ضدعفوني میشود. قارچ را نيز به آرامي با الكل 70% تميز ضد عفونی میکنند. تيغه چاقو با حرارت ضدعفوني شده و اجازه میدهند تا سرد شود سپس تكمه را از قاعده قطع کرده و بدون اينكه بخش داخلي آنرا لمس شود به به دو نيمه تقسيم میكنند.بخشي از بافت كلاهك را از قسمت مركزي قارچ جدا كرده و به  پتری حاوی محیط کشت مناسب انتقال میشود. اين كار را سه بار ديگر تكرار میگردد.
- پتري حاوي كشت قارچ را به مدت 4 تا 5 روز در ماي 30 تا 35 درجه سانتيگراد میگیرد.
- پس از اين مدت رويش ميسليومهاي قارچ در محيط كشت بايد پديدار گردد. اگر آلودگي در پتري شاهده ميشود قطعه كوچكي از ميسليومها را به محیط کشت جدید منتقل میکنند. در غیر اینصورت قطعاتی از آگار را به لولههای آزمایش حاوی محیط کشت شیبدار منتقل کرده و به مدت 48 ساعت در دمای 30 تا 32 درجه نگهداری میشود از قارچ موجود در این لوله ها بعدا"  برای تهیه اسپان می توان استفاده کرد.
2- محیطهای کشت قارچ:محیطهای کشت متفاوتی وجود دارد که با استفاده از آنها میتوان به کشت این قارچ اقدام نمود.
محیط PDA (Potato Dextrose Agar)
برای تهیه 1 لیتر محیط کشت PDA از 200 گرم سیبزمینی پوست کنده قطعه قطعه شده جوشانده شده تا مرز پختگی استفاده میشود.سپس محتوای ظرف را با عبور از یک پارچه پنبهای صاف کرده سیبزمینیها کنار گذاشته میشود.به عصاره بدست آمده 20 گرم دکستروز و 15 گرم آگار اضافه شده و حجم آن با آب مقطر استریل به یک لیتر میرسد.مخلوط حاصل را حرارت داده و به آرامی به هم میزنند تا آگار کاملاً حل شود.سپس محیط کشت به ارلنهای 250 میلیلیتری و یا لولههای آزمایش منتقل و با گلولههای پنبه درب آنها بسته میشود.ظروف حاوی محیط کشت به اتوکلاو و طوری در یک سطح شیبدار قرار میدهند که محیط کشت با پنبه برخورد نکند.
محیط کشت V8:  محیط کشت V8متشکل از یک لیتر آب، 50 میلیلیتر عصاره سبزیجات ()، 20 گرم آگار و 2/0 گرم کربنات کلسیم است.تهیه این محیط کشت نیز مشابه آنچه در بالا گفته شد میباشد همه محیطهای کشت باید در دمای 121 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شوند.لازم است به این نکته توجه شود که اکثر قارچهای خوراکی محیطهای کشت خنثی و یا تا حدی اسیدی یعنی PH حدود 5/5 تا 5/6 را ترجیح میدهد. با اینحال PH مناسب برای قارچ V. Volvacea،8/7-8/6 است. بنابراین باید از مناسب بودن PH محیط کشت برای قارچ مورد نظر اطمینان حاصل نمود.
محیطهای کشت مناسب برای تهیه اسپان:برای تهیه اسپان از مواد مختلفی به تنهایی و یا در ترکیب با سایر مواد میتوان استفاده کرد از جمله میتوان به کلش برنج، دانههای سورگوم و چاودار، بقایای محصول پنبه، تفاله چایی استفاده شده و غیره اشاره کرد. اسپان را باید به مدت 2 تا 3 هفته در دمای 32 درجه سانتیگراد نگهداری کرد و طی این مدت میسلیوم باید تمام فضای داخلی ظرف را پر نماید و معمولاً کلامیدوسپورهای قارچ نیز در سطح داخلی ظرف نمایان گردد.
توصیف دو نوع اسپانی که برای منظورهای کاربردی مورد استفاده قرار میگیرد در زیر آمده است:
1- اسپان بذر (مثل چاودار/ سورگوم/ گندم): برای تهیه این اسپان حدود 100 گرم بذر در 150 میلیلیتر آب قرار داده و به آن 2 گرم کربنات کلسیم اضافه میشود. اما ممکن است لازم باشد که نسبتها را بسته به تفاوتهای طبیعی که در بین واریتهها وجود دارد و نیز میزان رطوبت دانهها تغییر داد.
2- اسپان کلش (مثل کلش برنج): ساقههای برنج ابتدا به مدت 2 تا 4 ساعت خیسانده میشوند. سپس تمیز شده و در اندازههای 5-2 سانتیمتری قطعه قطعه میشود. سپس با کربنات کلسیم 1% و 1 تا 2 درصد سبوس برنج مخلوط شده و در بطریهای شیشهای دربدار گردن گشاد قرار داده میشود.
اسپان تفاله چای: تفالههای چای را میتوان از رستورانها جمعآوری کرد. این تفالهها ابتدا باید به خوبی شسته و آبکشی شود سپس به نسبت 2% به آنها کربنات کلسیم اضافه میشود تا PHآنها در محدوده 8/7 – 8/6 قرار گیرد. سپس این بستر به خوبی مخلوط میشود. این بستره را میتوان در ظروف شیشهای در پیچدار و یا کیسههای پلاستیکی مقاوم به حرارت (از جنس پروپیلین) قرار داد. در مورد اخیر یک حلقه پلاستیکی را باید در دهانه کیسه قرار داد و درب آنرا بوسیله پنبه مسدود کرد. هر یک از دهانهها سپس بوسیله کاغذ آلومینیومی پوشانده میشود.
اسپان ضایعات پنبه: از ضایعات پنبه برای تهیه اسپان میتوان استفاده کرد. روش کار مشابه آنچه که در مورد تفالههای چای گفته شد میباشد که به آن 2% کربنات کلسیم اضافه میشود. کربنات کلسیم اسیدهای تولید شده ناشی از متالولیزم میسلیومها را خنثی میکند.
5- اسپان سبوس – کود (Manure - Husk): مخلوطی از پهن تازه اسبی و سبوس لوتوس نیز برای تهیه اسپان مناسب شناخته شده است (Jalavicharana,1950). این دو با نسبت مساوی با هم مخلوط شود. قبل از این سبوس لوتوس به خوبی خیسانده میشود به شکلی که در طی فرآیند تبدیل شدن به کمپوست رطوبت خود را از دست ندهند. کود باید به خوبی مرطوب باشد ولی خیس نباشد. سپس این دو به خوبی با هم مخلوط شده و به صورت هرمهای یک متری بر روی هم کوپه میشود. سطح محل باید صاف و دارای پوشش برای جلوگیری از تابش مستقیم آفتاب و یا باران باشد. در طی 4 تا 5 روز دمای کمپوست بتدریج بالا میرود و گاهی در زمان اولین برگرداندن به بالاتر از 65 درجه سانتیگراد میرسد. اگر کمپوست خیلی خشک باشد باید مجدداً کمی مرطوب شده و به شکل قبلی کوپه گردد. دما مجدداً بالا خواهد رفت ولی در نهایت پایین میآید. پس از 4 تا 5 بار برگرداندن در طی دورههای هر 4 تا 5 روز یکبار دمای آن به 45-40 درجه میرسد و کمپوست آماده بطری گرفتن است. برای اطمینان از کافی بودن رطوبت کمپوست آنرا در بین دو کف دست فشرده کرده به شرط اینکه آبی از آن خارج نشود و پس از برداشتن فشار شکل خود حفظ نماید میزان رطوبت آن کافی است. کمپوست سپس وارد کیسههای پلاستیکی و یا قوطیهای آلومینیومی دربدار میشود. با یک وسیله نوک تیز روزنهای در داخل کمپوست ایجاد میشود پس از ضد عفونی کردن کمپوست میسلیومهای قارچ را در درون آن روزنه در مرکز کمپوست وارد میکنند. پس از حدود دو هفته برای استفاده آماده است. مراحل کامل تولید اسپان در شکل 14 نشان داده شده است.